質(zhì)粒最早是20世紀(jì)50年代初期在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的，是細(xì)菌、酵母菌、放線菌等生物中獨(dú)立于染色體(或擬核)以外的閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，具有自主復(fù)制能力，可在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。那么你知道影響質(zhì)粒構(gòu)建實(shí)驗(yàn)的因素有什么嗎？讓我們一起來看看吧！
 

　　一、載體的選擇
 

　　在選取克隆載體時(shí)應(yīng)留意以下幾點(diǎn)：
 

　?、倬邆渥灾鲝?fù)制能力，拷貝數(shù)量眾多；
 

　?、跀y帶易于篩選的選擇標(biāo)記；
 

　　③含有多種限制酶識(shí)別序列，以供外源基因插入；
 

　　二、引物設(shè)計(jì)留意事項(xiàng)
 

　　在構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)，設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)考慮引物長度、引物的GC含量、引物的Tm值等因素，并避免引物間出現(xiàn)配對突變或次級(jí)結(jié)構(gòu)等情況。
 

　　前向引物：5’端–上游克隆載體末端同源序列 + 基因正向擴(kuò)增引物 --3’端
 

　　反向引物：3’端–基因反向擴(kuò)增引物 + 下游克隆載體末端同源序列 --5’端
 

　　在運(yùn)用PCR擴(kuò)增目的基因的過程中，引物設(shè)計(jì)需留意事項(xiàng)：
 

　?、?引物長度最好在18-30bp左右，常用的長度是 20-22bp；
 

　?、谝?Tm 值最好在 60℃ 左右，兩條引物間 Tm 值要保持接近，相差最好不要超過 5°C；
 

　?、跥C 的含量標(biāo)準(zhǔn)通常為 40%-60% 或45-55%；
 

　　三、酶切位點(diǎn)的選擇
 

　　在構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)，選擇適當(dāng)?shù)那懈蠲负瓦B接酶至關(guān)重要。對于切割酶的選擇，應(yīng)該考慮到酶切位點(diǎn)的位置以及酶的反應(yīng)條件等因素。而對于連接酶的選擇，則應(yīng)根據(jù)所使用的質(zhì)粒載體和目標(biāo)基因的大小來確定。
 

　?、龠x擇質(zhì)粒上兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間的距離不宜過小(>10bp)，否則會(huì)影響限制性內(nèi)切酶對切點(diǎn)的識(shí)別，從而不利于空載體的雙重酶切。
 

　?、谠诳寺”磉_(dá)目的基因的情況下，選擇酶切位點(diǎn)時(shí)應(yīng)考慮以下因素：
 

　　目標(biāo)基因片段內(nèi)不應(yīng)含有所選酶切位點(diǎn)(否則在檢驗(yàn)陽性重組子的雙重酶切時(shí)可能會(huì)切斷目標(biāo)基因)。
 

　　③在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用的所有載體(真核、原核、酵母、昆蟲)盡可能含有所選的酶切位點(diǎn)，并且要確保插入載體時(shí)的方向正確(即定向克隆)，以免在更換載體進(jìn)行表達(dá)時(shí)需要重新設(shè)計(jì)引物以引入新的酶切位點(diǎn)。
 

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