免疫細(xì)胞化學(xué) (ICC) 是一種使用熒光抗體或染料來檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)靶抗原的技術(shù)。那么你知道免疫細(xì)胞（ICC）實(shí)驗(yàn)步驟有哪些嗎？讓我們一起來看看吧！

一、細(xì)胞培養(yǎng)/固定

很多抗原在離體組織中只存在很短時(shí)間，自溶（autolysis）和壞死（necrosis）使得抗原進(jìn)一步降解，組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)被破壞。樣品浸泡在合適的固定液中，固定液完quan滲透組織，使蛋白失去活性，并且使組織被保存、穩(wěn)定在接近 in vivo 狀態(tài)。

二、通透處理

通透即為對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行打孔處理，使抗體能進(jìn)入到細(xì)胞中和抗原發(fā)生結(jié)合。通常，當(dāng)抗體檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白時(shí)（包括抗原表位在胞內(nèi)段的跨膜蛋白），需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透，一般將細(xì)胞樣品在含 0.1-0.25% Triton X-100的PBS中孵育5-10分鐘。

三、封閉

對(duì)樣本進(jìn)行封閉，同樣是為了阻斷抗體抗原之間的非特異結(jié)合，降低背景和潛在假陽性染色。

四、一抗孵育

ICC 實(shí)驗(yàn)的成功也依賴于靶標(biāo)抗原特異性結(jié)合的一抗。

五、二抗孵育

對(duì)于間接檢測(cè)，二抗是成功顯示一抗分布的關(guān)鍵。使用二抗和相關(guān)檢測(cè)系統(tǒng)能夠擴(kuò)增信號(hào)，因?yàn)椴恢挂粋€(gè)二抗分子與單個(gè)一抗結(jié)合。

化學(xué)顯色與熒光檢測(cè)：您可以選擇化學(xué)顯色法，使用酶標(biāo)記的二抗，也可以選擇熒光法（免疫熒光），使用熒光染料標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測(cè)。

六、封片觀察

顯色完成后，通常會(huì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染，復(fù)染劑對(duì)特定的細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行染色，增加染色對(duì)比效果，明確細(xì)胞或亞細(xì)胞定位。

復(fù)染試劑的選擇取決于您對(duì)樣品的染色方式：顯色劑（一種在標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)顯微鏡下可見的染料）或熒光染色。

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