熒光原位雜交是一門新興的分子細胞遺傳學技術(shù)，目前這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學和基因組進化研究待許多領(lǐng)域。那么你知道熒光原位雜交實驗的方法與步驟是什么嗎？讓我們一起來看看吧！

一、探針變性

將探針在 75℃恒溫水浴中溫育 5 min，立即置 0℃，5～10 min，使雙鏈 DNA 探針變性。

二、標本變性

（1）將制備好的染色體玻片標本于 50℃培養(yǎng)箱中烤片 2～3 h。（經(jīng) Giemsa 染色的標本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片）。

（2）取出玻片標本，將其浸在 70～75℃的體積分數(shù) 70% 甲酰胺/2×SSC 的變性液中變性2～3 min。

（3）立即按順序?qū)吮窘?jīng)體積分數(shù) 70%、體積分數(shù) 90%和體積分數(shù) 100%冰乙醇系列脫水，每次 5 min，然后空氣干燥。

三、雜交

將已變性或預(yù)退火的 DNA 探針 10 μL 滴于已變性并脫水的玻片標本上，蓋上 18×18 蓋玻片，用 Parafilm 封片，置于潮濕暗盒中 37℃雜交過夜（約 15～17 h）。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)時間又長，因此為了保持標本的濕潤狀態(tài)，此過程在濕盒中進行。

四、洗脫

此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而降低本底。

（1）雜交次日，將標本從 37℃溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。

（2）將已雜交的玻片標本放置于已預(yù)熱 42～50℃的體積分數(shù) 50%甲酰胺/2×SSC 中洗滌3 次，每次 5 min。

（3）在已預(yù)熱 42～50℃的 1×SSC 中洗滌 3 次，每次 5 min。

（4）在室溫下，將玻片標本于 2×SSC 中輕洗一下。

（5）取出玻片，自然干燥。

（6）取 200 μL 復(fù)染溶液（PI/antifade 或 DAPI/antifade 染液）滴加在玻片標本上，蓋上蓋玻片。

五、雜交信號的放大（適用于使用生物素標記的探針）

（1）在玻片的雜交部位加 150 μL 封閉液 I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育 20min。

（2）去掉保鮮膜，再加 150 μL avidin-FITC 于標本上，用保鮮膜覆蓋，37℃繼續(xù)溫育 40 min。

（3）取出標本，將其放入已預(yù)熱 42～50℃的洗脫液中洗滌 3 次，每次 5 min。

（4）在玻片標本的雜交部位加 150 μL 封閉液 II，覆蓋保鮮膜，37℃溫育 20 min。

（5）去掉保鮮膜，加 150 μL antiavidin 于標本上，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育 40 min。

（6）取出標本，將其放入已預(yù)熱 42～50℃的新洗脫液中，洗滌 3 次，每次 5 min。

（7）重復(fù)步驟（1）、（2）、（3），再于 2×SSC 中室溫清洗一下。

（8）取出玻片，自然干燥。

（9）取 200 μL PI/antifade 染液滴加在玻片標本上，蓋上蓋玻片。

六、封片

可采用不同類型的封片液。如果封片液中不含有 Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持數(shù)月之久。

七、熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果

先在可見光源下找到具有細胞分裂相的視野，然后打開熒光激發(fā)光源，F(xiàn)ITC 的激發(fā)波長為490 nm。細胞被 PI 染成紅色，而經(jīng) FITC 標記的探針所在的位置發(fā)出綠色熒光。

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